非編碼RNA

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　　非編碼RNA（Non-coding RNA）是指不編碼蛋白質的RNA，包括miRNA、lncRNA、circRNA、piRNA等。非編碼RNA發揮功能的方式很多，可以與蛋白、DNA和RNA相互作用，參與多種細胞活動，主要包括基因的激活和沉默，RNA的剪接、修飾和編輯，蛋白質的翻譯等。

　　

　　1.miRNA：miRNA是一類由內源基因編碼的長度約為22個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，它們在動植物中參與轉錄后基因表達調控。每個miRNA可以有多個靶基因，而幾個miRNA也可以調節同一個基因。

　　

圖一 miRNA成熟及作用方式（Mikhailidis DP, Athyros VG. Nat Rev Cardiol. 2014 Feb;11(2):72-4.）

　　

　　 miRNA過表達：將miRNA前體序列構建入病毒載體中，該載體既可用于瞬時轉染細胞，也可以包裝成病毒用于穩定株篩選和動物水平過表達miRNA。

　　

　　miRNA敲低：設計針對miRNA的TuD RNA封閉片段或海綿片段，再將該片段構建入病毒載體中。該載體除了可以直接瞬時轉染細胞用于miRNA的敲低，也可以包裝成慢病毒，用于動物水平敲低miRNA。

　　

　　miRNA靶基因預測：miRNA通過堿基互補配對的方式識別靶基因的3’UTR區，并根據互補程度的不同指導沉默復合體降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻譯。因此，可以將目的基因的3’UTR區域構建到含luciferase的報告基因上，通過比較miRNA過表達或inhibitor 與報告基因作用檢測熒光值的變化，判斷miRNA對靶基因的作用。再通過對3’UTR區進行定點突變的方法進一步確定miRNA與靶基因3’UTR的作用位點。

　　

　　miRNA常用數據庫：

　　

　　 （1）miRbase（http://www.mirbase.org）：miRbase 是由曼徹斯特大學的研究人員開發的一個在線的miRNA數據庫，提供包括已發表的miRNA序列數據、注釋、預測基因靶標等信息的全方位數據庫，是存儲miRNA信息最主要的公共數據庫之一。

　　

　?。?）TargetScan（http://www.targetscan.org/）：TargetScan是通過搜索和每條miRNA種子區域匹配的保守的8mer和7mer位點來預測靶基因。

　　

　?。?）TarBase（http://carolina.imis.athena-innovation.gr/diana_tools/web/index.php?r=tarbasev8%2Findex）：TarBase數據庫人工經歷了長達10年左右的時間去搜集了實驗驗證過的miRNA的靶基因，包括在人、小鼠、果蠅、蠕蟲和斑馬魚中的miRNA的靶基因。

　　

　?。?）miRWalk（http://www.ma.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk/）：miRWalkis是一個綜合性數據庫，提供來自人類、小鼠和大鼠的miRNA的預測信息和經過驗證的位于其靶基因上的結位點。

　　

　　2.lncRNA：lncRNA是長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA）的簡稱，是長度在200-100000 nt之間的RNA分子。大多數的lncRNAs在組織分化發育過程中，都具有明顯的時空表達特異性；序列上保守性較低，只有約12%的lncRNA可在人類之外的其它生物中找到。

　　

　　根據lncRNA在基因組上相對于蛋白編碼基因的位置，可以將其分為啟動子區（promoter associated）、內含子間（intronic）、雙向（bidirectional）、正義鏈（sense）、反義鏈（antisense）、3’UTR區（3’UTR associated）、基因間（intergenic）這7種類型。這種位置關系對于推測lncRNA的功能有很大幫助。

　　

　　圖二 lncRNA分類（Huang X, et al.Cancer Lett. 2018 Jan 28;413:94-101.）

　　

　　一般來說，lncRNA主要從以下三種層面實現對基因表達的調控：

　　

　?。?）表觀遺傳學調控：lncRNA招募染色質重構復合體到特定位點進而介導相關基因的表達沉默。

　　

　?。?）轉錄調控：包括如下幾種：1）lncRNA的轉錄能夠干擾臨近基因的表達；2）lncRNA能夠通過封阻啟動子區域來干擾基因的表達；3）lncRNA能夠與RNA結合蛋白作用，并將其定位到基因啟動子區從而調控基因的表達；4）lncRNA能夠調節轉錄因子的活性；5）lncRNA也能夠通過調節基本轉錄因子來實現調控基因的表達。

　　

　?。?）轉錄后調控：lncRNA能夠在轉錄后水平通過與mRNA形成雙鏈的形式調控基因的表達。

　　

　　lncRNA過表達：將lncRNA序列構建入病毒載體中，該載體既可用于瞬時轉染細胞，也可以包裝成病毒用于穩定株篩選和動物水平過表達lncRNA。

　　

　　lncRNA干擾：針對lncRNA設計干擾片段，再將該片段構建入病毒載體中。該載體除了可以直接瞬時轉染細胞用于lncRNA的干擾，也可以包裝成慢病毒，用于動物水平干擾lncRNA。

　　

　　lncRNA敲除：用CRISPR/Cas9技術對lncRNA進行敲除。針對lncRNA某條片段的兩端分別設計多條sgRNA序列，實現大片段刪除，從而達到敲除的效果。將sgRNA序列構建入病毒載體中，再將Cas9序列裝入另一載體中，隨后兩種病毒同時感染目的細胞進行敲除。

　　

　　lncRNA靶基因尋找：方法基本類似于上面表述的miRNA雙熒光素酶檢測。

　　

　　3.circRNA: circRNA即環形RNA（circular RNA）的簡稱，是一類不具有5’末端帽子和3’ 末端poly（A）尾巴、并以共價鍵形成環形結構的客觀存在于生物體內的非編碼RNA分子。

　　

　　circRNA主要特征：

　　

　?。?）circRNA由特殊可變剪切產生，大量存在與真核細胞的細胞質中，主要來源于外顯子，少部分內含子來源的circRNA存在細胞核中。

　　

　?。?）表達水平具有種屬、組織、時間特異性。

　　

　?。?）circRNA呈閉合環狀結構，不易被核酸外切酶降解，比線性RNA更加穩定。

　　

　?。?）具有一定序列保守性。

　　

　?。?）在轉錄或轉錄后水平發揮調控作用。

　　

　?。?）絕大多數circRNA是非編碼的，但也有少數可以翻譯為多肽。

　　

　　circRNA根據其來源可分為三類：外顯子來源的circRNA（exonic circRNAs），內含子來源的circRNA（circular intronic RNAs，ciRNAs），以及由外顯子和內含子共同組成的circRNA（retained-intron circRNAs）。

　　

　　circRNA的作用機制：

　　

　　miRNA分子海綿，circRNA含有大量的miRNA結合位點，具有miRNA海綿作用，進而間接調控miRNA下游靶基因的表達。

 

　　
 

　　調控基因轉錄，circRNA也可以通過與RNA結合蛋白的結合來調控蛋白功能，比如通過與轉錄因子的結合來抑制基因的轉錄。

　　

　　編碼功能，circRNA雖然屬于非編碼RNA，但是也有少數circRNA可以編碼多肽，通過該多肽行使調控功能。

　　

　　circRNA過表達：同上述的lncRNA步驟類似，但是circRNA過表達由于成環效率的影響，其難度相對普通基因的過表達更大。

　　

　　circRNA干擾：同上述的lncRNA方法步驟。

　　

　　circRNA敲除：同上述的lncRNA方法步驟。

　　

　　circRNA靶基因尋找：同上述的miRNA和lncRNA雙熒光素酶檢測方法。

　　

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