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外泌體（Exosomes）是細胞分泌到胞外的一種囊泡（Extracellular Vesicles，EVs），其大小為30-150nm，具有雙層膜結構和茶托狀形態，含有豐富的內含物（包括核酸、蛋白和脂質等），參與細胞間的分子傳遞。外泌體廣泛存在于細胞培養上清以及各種體液中，包括血液、淋巴液、唾液、尿液、精液、乳汁等，同時也存在于組織樣本中，如腦組織、肌肉組織、脂肪組織等。
腦組織分離方法簡述：將腦組織剪成薄片，放入離心管中加上消化液進行消化，經水浴、反復輕輕上下顛倒，再用移液槍間斷緩慢吹吸至消化結束。隨后加入培養基于消化液中，混勻，置于冰上。再進行一系列的差速超速離心過程，包括除雜、濾膜過濾、超離等。最后用PBS重懸外泌體，用重懸后的外泌體進行下面的透射電鏡（TEM）、納米粒徑跟蹤分子（NTA）和marker WB鑒定。
圖一 胞外囊泡分泌
所有的細胞都能分泌外泌體，但是不同細胞分泌的外泌體不管在數量上還是在內含物中都具有很大的差異性，這也決定了每種外泌體所行使的功能不一樣。外泌體廣泛參與細胞間物質運輸與信息傳遞，調控細胞生理活動。同時，外泌體具有抗原提呈、免疫逃逸、誘導正常細胞轉化、促進腫瘤發生和轉移等作用；此外，外泌體還可以作為“天然的納米粒子”來進行藥物遞送。
外泌體相關數據庫有哪些？
l exoRBase數據庫收集和描述人類血液外泌體中所有長的RNA，包括circRNA、lncRNA和mRNA。
l EVpedia和Vesiclepedia數據庫匯總了不同囊泡研究中發現的蛋白、mRNA、miRNA、脂類等信息。
l ExoCarta數據庫主要收錄了包括人、大鼠、小鼠、綿羊等幾個物種的286個研究結果，涉及蛋白、mRNA、miRNA、脂類等信息。
樣本預處理與外泌體分離、保存：
外泌體存在于人類或動物的各種體液中，我們可以選擇不同的樣本來源進行相關的外泌體研究。由于外泌體是來源于細胞質膜內陷的含有脂質雙分子層膜結構的多泡小體，分布于胞外基質。為了獲得高純度的外泌體，必須確保有效去除所有的細胞碎片及其他不需要的雜質。
1） 細胞培養上清 2）血漿/血清
3）尿液 4）腦脊液
5）卵泡液 6）宮腔液
7）膽汁 8）羊水
9）腹水 10）胸腔液
不同的實驗樣本采集時需要注意的地方不一樣，如細胞培養上清在收集樣本前需換成無外泌體血清培養、血漿樣本采集時用一定不能用肝素抗凝管、尿液收集時需要加抑菌劑等。
從生物體液中分離外泌體的各種方法已經被開發出來，主要根據外泌體的大小、密度、免疫特性等特點進行操作。分離出高純度的外泌體是我們后續開展外泌體研究的關鍵步驟，目前差速超速離心是外泌體分離方法中公認的“金標準”，也是高分文章中首選的分離方法。
外泌體提取在短時間（一周之內）使用，可以放在4度保存，如果長時間保存可以放在-20度或-80度保存。也可以將外泌體進行分裝，分別放在-20度或-80度。
外泌體檢測方法：
外泌體分離之后，需要經過一系列鑒定才能確定分離的是外泌體。鑒定方法從物理特征到表面分子標志物，多角度進行鑒定。
l 透射電鏡鑒定法：簡稱TEM，適合外泌體雙層囊膜超微結構觀察，即通常為茶托型或一側凹陷的半球形。
圖二 透射電鏡
l 納米顆粒跟蹤分析法：簡稱NTA，該方法能保證外泌體原始狀態、檢測速度快，檢測后能提供外泌體粒徑和濃度信息。
圖三 NTA
l Western blot分子標志物檢測：外泌體標志蛋白包括四跨膜蛋白家族，如CD9、CD63和CD81；細胞質蛋白，如肌動蛋白（Actin）和鈣磷脂結合蛋白（Annexins）；參與生物功能的分子，如凋亡轉接基因2互作蛋白X（ALIX）、腫瘤易感基因101蛋白（TSG101）、熱休克蛋白（HSP70、HSP90），以及細胞分泌的特異性蛋白。
圖四 Western Blot（Tian Su et al., ACS Nano. 2019）
外泌體高通量檢測
外泌體內含有與細胞來源相關的蛋白質和核酸，可以運輸蛋白質、mRNA、miRNA、lncRNA、circRNA等進入受體細胞，參與細胞間通訊。不同細胞來源的外泌體所含有的蛋白成分和RNA不太相同，可作為多種疾病的早期診斷標記物，也能作為靶向藥物的載體進行疾病治療。
1. miRNA高通量測序
2. mRNA高通量測序
3. lncRNA芯片（人、小鼠）
4. ceRNA芯片（人、小鼠）
5. 蛋白質組分析（iTRAQ、TMT、Label-free）
外泌體標記或示蹤：
l 親脂染料標記外泌體：目前已發表的外泌體文章中，外泌體大多使用親脂性染料進行標記，體內和體外都有較多應用。親脂性染料主要分為兩大類，第一類是PKH67（綠色熒光）/PKH26（紅色熒光），由于它們可以與外泌體的脂質雙層膜穩定結合，所以染色效果較好，應用較廣泛。
圖五 PKH67標記的外泌體與神經元之間相互作用（Juan Carlos Polanco et al., Acta Neuropathol Commun. 2018）
圖六 PKH26標記的外泌體與MDA‐MB‐231細胞共培養（Mengyu Yu et al., Cancer Sci. 2019）
第二類是Di系列的親脂性染料，包括DiI（橙色熒光）、DiO（綠色熒光）、DiD（紅色熒光）、DiR（深紅色熒光）。其中DiR的紅外熒光可穿透細胞和組織，在活體成像中用來示蹤。
圖七 DiI標記的外泌體通過靜脈注射觀察在體內器官的分布情況（Laura Otero-Ortega et al., J Cereb Blood Flow Metab. 2018）
l 慢病毒介導CD63-GFP表達：將外泌體的特定蛋白CD63和綠色熒光蛋白GFP的表達元件構建成質粒再包裝到慢病毒中，隨后用此慢病毒感染細胞，使細胞分泌的外泌體帶有綠色熒光。
圖八 用GFP標記的外泌體分別與SH-SY5Y、BV2和DRG細胞共培養（Rui Ren et al., Artif Cells Nanomed Biotechnol. 2019）
圖九 注射有CD63-GFP的外泌體后觀察第1天(D1)和第5天(D2)的熒光（Rui Ren et al., Artif Cells Nanomed Biotechnol. 2019）
外泌體功能研究：
將標記的外泌體加入受體細胞培養基中，與受體細胞進行共培養，觀察細胞的功能變化，如細胞增殖、遷移與侵襲、細胞凋亡等；或者將外泌體注射入動物模型中，觀察動物表型變化和檢測動物相關指標。
圖十 DiR標記的外泌體靜脈注射小鼠結腸癌腫瘤模型（Gaofeng Liang et al., J Nanobiotechnology. 2020）
圖十一 外泌體的功能研究（Tian Fang et al., Nat Commun. 2018）
我們的優勢：
1) 實驗周期短；
2) 價格優惠；
3) 完善的售后服務；
4) 項目經驗豐富，成功率幾乎100%；
5) 完整的一套實驗服務。
我們提供的服務：
1) 差速超速離心分離；
2) 透射電鏡拍攝（TEM）；
3) 納米粒徑跟蹤分析（NTA）；
4) Western Blot檢測蛋白標志物；
5) 外泌體高通量測序/芯片；
6) 外泌體標記或示蹤；
7) 外泌體細胞功能檢測；
8) 外泌體動物注射；
9) 外泌體動物模型驗證等。
