細胞功能學實驗

　　細胞增殖與細胞凋亡、細胞周期等是腫瘤研究的重要表型，是分子生物學和藥理學研究解決的問題之一。通過在細胞中過表達或干擾某個基因研究基因對細胞增殖能力的影響，進一步研究基因的功能，或對細胞進行藥物處理，研究藥物對增殖的影響。

　　實驗原理(CCK-8)

　　細胞增殖是生物體的重要生命特征，細胞以分裂的方式進行增殖，是生物體生長、發育、繁殖和遺傳的基礎。細胞增殖的研究方法有很多，主要包括：CCK8/ CellTiter-Glo™等方法。

　　Cell Counting Kit-8（簡稱CCK-8）試劑可用于簡便而準確的細胞增殖和毒性分析。其基本原理為：該試劑中含有WST-8【化學名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽】，它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被細胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產物（Formazan dye）。生成的甲瓚物的數量與活細胞的數量成正比。因此可利用這一特性直接進行細胞增殖和毒性分析。
 

 

　　細胞凋亡是腫瘤和發育研究的重點，同時也是藥理學研究的熱點。細胞凋亡是指細胞在一定的生理或病理條件下，遵循自身的程序，自主結束其生命的過程。它是一個主動的，高度有序的，基因控制的，一系列酶參與的過程。細胞凋亡的過程大致可分為以下幾個階段：接受凋亡信號→凋亡調控分子間的相互作用→蛋白水解酶的活化（Caspase）→進入連續反應過程。

　　基本原理

　　細胞凋亡檢測采用Annexin V/PI雙染法檢測，Annexin V是一種分子量為35~36kD的Ca2+依賴性磷脂結合蛋白，能與磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine，PS）高親和力特異性結合。在細胞凋亡的早期，PS可從細胞膜的內側翻轉到細胞膜的表面，暴露在細胞外環境中。將Annexin V 進行熒光素（FITC或PE）或Biotin 標記，以標記了的Annexin V 作為熒光探針，利用流式細胞儀或熒光顯微鏡可檢測細胞凋亡的發生。

　　7-AAD類似于碘化丙啶（propidine iodide，PI）是一種核酸染料，它不能透過完整的細胞膜，但在凋亡中晚期的細胞和死細胞，7-AAD能夠透過細胞膜而使細胞核紅染。因此將Annexin V 與7-AAD 匹配使用，就可以將凋亡早晚期的細胞以及死細胞區分開來。

　　目的： 通過慢病毒感染獲得過表達某基因的細胞株，利用Annexin-PE和7-AAD雙染法對正常細胞、對照組細胞、基因過表達組細胞的凋亡情況進行檢測，研究基因對細胞凋亡的影響。

　　材料：質粒與細胞株

　　步驟：細胞準備——收集細胞——Annexin-PE和 7-AAD進行雙染色——流式上機檢測

　　在腫瘤發展過程中，細胞進入循環系統的能力是重要的研究對象。相關的信號通路主要可以分為控制細胞黏附和控制細胞骨架。細胞的遷移與侵襲主要與細胞骨架和黏附相關。腫瘤細胞侵襲和遷移能力的改變通常采用Transwell進行檢測。細胞劃痕也是測定腫瘤細胞運動特性的方法，由于無法區別正常增殖和遷移細胞，應用有局限性。

　　
       Transwell實驗

　　Transwell小室底層的一張有通透性的膜（一般為聚碳酸酯膜），將其放置于孔板中，小室內稱上室，培養板內稱下室。由于聚碳酸酯膜有通透性，下層培養液中的成分可以影響到上室內的細胞。應用Transwell可研究下層培養液中的成分對細胞生長、運動等的影響。

　　腫瘤遷移實驗：研究腫瘤細胞的遷移能力或特定情況下腫瘤細胞的遷移能力。常用8.0、12.0µm膜，上室種腫瘤細胞，下室加入FBS或某些特定的趨化因子，腫瘤細胞會向營養成分高的下室跑，計數進入下室的細胞量可反映腫瘤細胞的遷移能力。

　　腫瘤侵襲實驗：研究腫瘤細胞的侵襲能力或特定情況下腫瘤細胞的侵襲能力。在聚碳酸酯膜上涂上一層基質膠，模仿細胞外基質，上室種腫瘤細胞，下室加入FBS或某些特定的趨化因子，細胞要把基質消化后才可以從上室遷移到下室，計數進入下室的細胞量測定細胞的侵襲能力。

　　目的： 研究目的基因過表達/干擾對細胞侵襲、轉移能力的影響

　　材料：正常細胞、對照慢病毒、過表達基因慢病毒

　　步驟：細胞復蘇——Transwell鋪板——細胞培養及染色——拍照

　　

 

　　細胞周期（cell cycle）是指細胞從一次分裂完成開始到下一次分裂結束所經歷的全過程，分為間期與分裂期兩個階段。細胞周期反應了細胞增殖速度，單個細胞的周期測定可采用縮時攝影的方法，但它不能代表細胞群體的周期，故現多采用其他方法測群體周期。

　　原理：

　　細胞周期各時相的DNA含量不同，通常正常細胞的 G0/G1期具有二倍體細胞的DNA 含量(2N)，而G2/M期具有四倍體細胞的DNA含量(4N)，而S期的DNA含量介于二倍體和四倍體之間。PI 即碘化丙錠，可以與細胞內DNA 和RNA 結合，采用RNA酶將RNA消化后，通過流式細胞術檢測到的與DNA 結合的PI 的熒光強度直接反映了細胞內DNA含量的多少。

　　因此，通過流式細胞術PI染色法對細胞內DNA含量進行檢測時，可以將細胞周期各時相區分為 G0/G1期，S 期和G2/M期，并可通過特殊軟件計算各時相的百分率。

　　目的： 通過慢病毒感染獲得基因過表達的細胞株，利用PI染色法結合流式細胞術檢測各組細胞周期的變化。從而研究目的基因對細胞周期的影響。

　　材料：目的細胞、病毒

　　步驟：細胞準備——樣品收集——上機檢測——數據分析

　　原理：單個細胞在體外增殖6代以上（時間約1周以上），其后代所形成的細胞群體，稱為集落或克隆。每個克隆含有50個以上的細胞，大小在0.3 - 1.0mm之間。細胞接種存活率只表示接種細胞后貼壁的細胞數， 但貼壁后的細胞不一定每個都能增殖并形成克隆。只有同時具有貼壁和增殖活力的細胞才會形成克隆?？寺⌒纬陕史从臣毎莫毩⑸婺芰Φ膹娙?，用于評價細胞群體依賴性和增殖能力。由于細胞生物學性狀不同，細胞克隆形成率差別也很大，一般初代培養細胞克隆形成率弱，傳代細胞系強； 二倍體細胞克隆形成率弱，轉化細胞系強；正常細胞克隆形成率弱，腫瘤細胞強?？寺⌒纬陕逝c接種密度有一定關系，做克隆形成率測定時，接種細胞一定要分散成單細胞懸液，直接接種在培養皿中，持續一周以上，隨時檢查，到細胞形成克隆時終止培養。

　　目的：通過目的基因過表達/干擾細胞組、空細胞組與陰性對照組(空病毒)克隆形成數量的統計學分析，研究基因對細胞群體依賴性和增殖能力的影響。

　　材料：病毒和細胞株

　　步驟：鋪板——細胞培養——觀察克隆，染色，計算克隆形成率